Sanja Nikolić, Olivera Aleksić Hil
UVOD:
Napredak nauke i tehnologije tokom proteklih 150 godina, jasno pokazuju da su nasledni faktori, koji se prenose sa generacije na generaciju, u najvećem delu ključni za uočene varijacije između vrsta i unutar vrste. Iako se složenost ljudskog postojanja ne može jednostavno svesti samo na efekte gena, naučna je istina da genetički faktori čine biološku bazu za mnoge potencijale jedinke i vulnerabilnosti.
DIJAGNOSTIKA I SKRINING GENETIČKIH POREMEĆAJA – MOGUĆNOST PREVENCIJE
Sva svojstva čoveka, karakteristike njegovog tela i uma, njegovo fizičko i mentalno zdravlje uslovljeni su medjusobnim delovanjem naslednih faktora i spoljašnje sredine u kojoj se razvija i živi. Svojstva svakog organizma se razvijaju pod kontrolom nasledne osnove u granicama odredjene intracelularne, ekstracelularne i spoljašnje sredine. Nasledjivanje jednog gena nije automatski ekvivalentno razviću odredjenog svojstva. Intracelularna sredina gena u prvom redu obuhvata druge gene i njihovu kompleksnu funkcionalnu reakciju, kao i citoplazmu, koja takodje u znatnoj meri utiče na razviće odredjenog svojstva. .
Hromozomske promene mogu obuhvatiti cele setove hromozoma, pojedinačne hromozome ili pak delove hromozoma. Za većinu hromozomskih aberacija karakteristični su zajednički klinički simptomi što ukazuje da odstupanja u količini genetičkog materijala dovode do poremećaja u interakciji gena, što ima za posledicu poremećaj embrionalnog razvića. Klinički značajni hromozomski defekti se detektuju sa učestalošću od 0,65% u populaciji novorodjene dece, dok se 0,2% njih radja sa balansiranim strukturnim hromozomskim rearanžmanom (uglavnom bez klinički značajne fenotipske ekspresije) sa značajnim implikacijama na reprodukciju, kasnije u životu.
Kada su u pitanju monogenski autosomno dominantni i recesivni poremećaji, kao i oboljenja vezana za X hromozom, rizik ponovnog u porodici je značajan. Približno 6400 do sada detektovanih monogenskih poremećaja (tačkaste-point mutacije) javljaju se sa incidencijom od 3,6 na 1000 porodjaja, dok kod poligenskih poremećaja sa multifaktorijalnom etiologijom ona iznosi čak 46,4 na 1000 porodjaja sa najčešćom ekspresijom u adolescentnom i odraslom dobu (kancerogeni, psihijatrijski, neurodegenerativni, kardiovaskularni poremećaji itd.).
Genetski poremećaji, znači, imaju značajnog udela u oboljevanju i smrtnosti kako dece tako i odraslih te je genetičko savetovanje postalo jedna od najznačajnijih oblasti humane genetike i medicine uopšte. Genetičko savetovanje predstavlja komunikacioni proces i svestranu pomoć porodici u razumevanju genetičkih implikacija nakon postavljene pravilne dijagnoze, zatim procenu rizika javljanja naslednog poremećaja ili bolesti u porodici , ocenu prognoze i vrednosti mogućih oblika prevencije i lečenja, kao i pomoć i podršku porodici u donošenju konačne odluke. Fundamentalni značaj za roditelje sa rizikom radjanja deteta sa anomalijama ili nekom naslednom bolešću predstavlja mogućnost prenatalne dijagnoze i mogućnost selektivnog pobačaja oštećenog ploda.
Najčešće primenjivane metode prenatalne dijagnoze za detekciju hromozomopatija kao i urodjenih monogenskih poremećaja mogu biti:
A) neinvazivne (tripl test, odredjivanje nivoa biohemijskih markera u serumu trudnice)
B) invazivne u koje spadaju:
Amniocenteza (AC), putem koje se dobijaju ćelije plodove vode (izmedju 16 i 18 nedelje ultrazvučne zrelosti ploda, odnosno i znatno ranije, čak pre 13. gestacione nedelje kod rane amniocenteze), koje se mogu kultivisati i koristiti za analizu kariotipa ploda kao i za detekciju oko 60 urodjenih biohemijskih poremećaja i svakim danom sve više monogenskih bolesti, detekcijom na molekularnom nivou.
Analiza horionskih resica (CVS), metoda koja se primenjuje ranije, u prvom trimestru trudnoće. Ima izvesnu prednost u odnosu na amniocentezu jer stvara manje psiholoških trauma kod trudnica a i eventualni prekid trudnoće se može obaviti blagovremeno, do desete nedelje gestacije. Medjutim, postoji nešto veći rizik od spontanog pobačaja kao i pojave hromozomskog mozaicizma, poreklom od placente koji može uticati na validnost dobijenog nalaza kariotipa.
Analiza uzorka fetalne krvi, dobijene kordocentezom nakon 20.nedelje trudnoće. Nakon kultivacije fetalnih limfocita, nalaz kariotipa se dobija za 48-72 sati. Apsolutna indikacija je kada su fetalne morfološke anomalije (patološki ultrazvučni markeri) uočeni kasnije u trudnoći.
APSOLUTNE I RELATIVNE INDIKACIJE ZA PRIMENU METODA PRENATALNE DIJAGNOZE HROMOZOPATIJA I GENOPATIJA
Jedna od apsolutnih indikacija za primenu metoda prenatalne dijagnoze hromozomopatija i genopatija je svakako starost majke.Trudnice starije od 35 godina imaju povećan rizik za radjanje deteta sa trizomijom hromozoma 21 (Downow sindrom), koja najčešće nastaje usled grešaka u mejozi majke.
Edwardsov sindrom (trizomija hromozoma 18), Patau sindrom (najčešće uzrokovan trizomijom hromozoma 13), kao najčešće posledice neodvajanja hromozoma u mejozi jednog roditelja. Fenotip se odlikuje teškim multiplim anomalijama i samo oko 10% aficirane dece preživi prvu godinu života.U okviru ove grupe trudnica značajno je veća i učestalost radjanja dece sa trizomijom polnih hromozoma: Klinefelterov sindrom (kariotip XXY kao) i trizomija X. Trudnice starije od 35 godina predstavljaju jednu od najznačajnijih ciljnih grupa za primenu jedne od metoda invazivne prenatalne dijagnoze, pri čemu je pomenuta starosna granica arbitrarno utvrdjena (jer rizik postepeno raste sa godinama majke), te ne obezbedjuje potpunu prevenciju hromozomopatija. U cilju prevazilaženja toga, veliki napredak je postignut poslednjih godina sprovodjenjem sistematskog skrininga svih trudnica odredjivanjem titra biohemijskih markera (AFP, BETA-HCG i slobodni estriol-tripl test) u serumu majke. U slučaju precizno utvrdjenih odstupanja, roditeljima se savetuje primena jedne od metoda invazivne prenatalne dijagnostike
Strukturni hromozomski rearanžmani
Recipročna translokacija (kao rezultat hromozomskog prekida dva nehomologa hromozoma i posledične razmene segmenata). Nosioci balansiranih translokacija su uglavnom bez patološke fenotipske ekspresije, ali u procesu gametogeneze su pod velikim rizikom da produkuju gamete sa aberantnom hromozomskom konstitucijom i radjanje potomstva sa patološkim kariotipom, samim tim sa multiplim kongenitalnim anomalijama od kojih je najupadljivija mentalna retardacija.
Robertsonova translokacija (je rezultat spajanja dugih kraka akrocentričnih hromozoma u jedan metacentrični ili submetacentrični hromozom).Veći rizik za radjanje trizomičnog potomstva imaju nosioci balansirane translokacije u koju je uključen hromozom 21 (dete sa Downovim sindromom) i to prevashodno ako je majka nosilac iste.
Inverzije hromozoma (su rezultat dva prekida u okviru jednog hromozoma i obrtanja segmenta izmedju tačaka prekida za 180 stepeni, pri čemu se remeti linearni raspored gena).Obzirom da ne postoji genetički debalans, nosioci inverzija su somatski i psihički zdrave osobe ali se štetnost ovakvog strukturnog rearanžmana izražava kod potomstva.
Opterećena akušerska anamneza (ili apsolutne indikacije za genetičko ispitivanje): ponovljeni spontani pobačaji, intrauterina ili perinatalna smrt ploda, infertilitet bez jasnog etiološkog uzroka.
Sindrom fragilnog X hromozoma (Sy FrX)
Sy Fr X je najčešći uzročnik nasledne mentalne retardacije, kod preko 20% aficiranih sa fenotipskom ekspresijom najčešće kod muškog pola. FMR1 (“Fragile X mental retardation”) gen kloniran je 1991.godine i pružio je mnoge korisne informacije o etiologiji ovog poremećaja, koji se klasifikuje kao “dinamička mutacija” i pokazuje jasno fenomen anticipacije, odnosno pojavu sve teže kliničke slike u svakoj narednoj generaciji, usled amplifikacije ponavljajućeg tripleta baza pri čemu dolazi do hipermetilacije I inaktivacije samog gena. Fragilno mesto locirano je na dugom kraku hromozoma X u nivou Xq 27.3. Adaptirane metode klasične citogenetike (kultivacija ćelija u podlogama siromašnim folatima npr.) omogućavaju vizuelizaciju fragilnog mesta u vidu pukotine, prekida ili bisatelitne konfiguracije na distalnom delu dugog kraka hromozoma X. Fenotipske karakteristike ovog sindroma kod aficiranih muškaraca su detaljno opisane a najupadljivija je umerena do teška mentalna retardacija.Takodje je kod približno 8% autističnih individua detektovana mutacija FMR1 gena, pri čemu najnoviji podaci govore u prilog tome da je ova mutacija direktan etiološki uzročnik intelektualnog deficita i da se kod ovih pacijenata mogu javiti klinički znaci autizma ali simptomi nisu sveprožimajući
Kao što je već istaknuto, incidencija hromozomskih aberacija u novorodjenčadi je značajna i prema zbirnim podacima iz velikog broja citogenetičkih laboratorija na svakih 160 porodjaja radja se jedno dete sa hromozomskim anomalijama. Primenom klasičnih metoda citogenetike omogućena je analiza hromozoma i veoma pouzdana detekcija najvećeg broja numeričkih i strukturnih aberacija.Medjutim, ove klasične metode imaju i značajna ograničenja, pre svega nemogućnost pouzdane detekcije mikrostrukturnih rearanžmana hromozoma kao i utvrdjivanje porekla naslednog materijala u višku (npr.marker hromozomi). Poslednjih godina metode molekularne citogenetike a pre svih tehnika fluorescentne in sity hibridizacije –FISH, dovele su do revolucionarnog pomaka kako u oblasti bazičnih istraživanja tako i u okviru kliničkih studija na hromozomima. FISH je nova, precizna i brza metoda koja omogućava vizuelnu identifikaciju hromozoma i interfaznih jedara na fiksiranim mikroskopskim preparatima.
Analizom metafaznih hromozoma detektujemo:
- Mikrodeleciju i potvrdu dijagnoze mikrodelecionih sindroma koji su uglavnom klinički prepoznatljivi: Prader-Willi i Angelmanov sindrom u slučaju kada je u osnovi sindroma mikrodelecija u nivou dugog kraka hromozoma 15 u nivou 15q11-15q13 DeGeorge sindrom i Velokardiofacijalni sindrom sa mikrodelecijom u nivou 22q11.2-22q11.22, Williamsov sindrom sa delecijom u nivou 7q11.23, Smith-Magenis sindrom sa delecijom na kratkom kraku hromozoma 17 u nivou 17p11.
Svi navedeni poremećaji se karakterišu prisustvom različitih upadljivih fenotipskih manifestacija koje, izmedju ostalog, uključuju i hipotoniju, hipogonadizam, mikrocefaliju, dizmorfični facies, konotrunkalne defekte, periferne neuropatije i mentalnu retardaciju u svim slučajevima. Sve izneto ukazuje na važnost prenatalne dijagnoze pomenutih mikrodelecionih sindroma, koja je do primene FISH metode bila samo delimično uspešna korišćenjem metoda visoke rezolucije benda. Sada smo u mogućnosti da ove poremećaje detektujemo i prenatalno i postnatalno (što je značajno jer se u 5-10% slučajeva javlja porodična transmisija). Uzorci koji se koriste za analizu metafaznih hromozoma su isti kao i kod klasičnih citogenetskih metoda, jedra limfocita periferne krvi, ćelije plodove vode, horionskih resica kao i kultivisani fibroblasti kože a najčešće se primenjuju probe za pojedinačne gene ( SNRPN I YACs probe).
- Karakterizacija mikrostrukturno izmenjenih hromozoma, tzv. kriptični rearanžmani. Detekcija ovakvih submikroskopskih promena često je bila nemoguća primenom metoda klasične citogenetike, čak i tehnika visoke rezolucije benda i specificnim tehnikama bojenja. Primenom metoda molekularne genetike i korišćenjem proba za pojedinačne gene, sada smo u mogućnosti da brzo i pouzdano detektujemo nebalansirani kariotip fetusa i na taj način roditeljima, nosiocima mikrostrukturnih rearanžmana omogućimo radjanje zdravog potomstva.
- Utvrdjivanje porekla marker hromozoma, tj.hromozomskog materijala koji ne može biti klasifikovan primenom konvencionalnih metoda bojenja. Klasifikacijom marker hromozoma omogućeno je urvrdjivanje korelacije izmedju kariotipa i fenotipske ekspresije.
- Duplikacije hromozoma se najčešće detektuju kod fenotipski aficiranih individua, dok se izuzetno retko sreću bez odredjene fenotipske ekspresije. Mogu se javiti kao posledica različitih strukturnih rearanžmana, najčešće kao rezultat nepravilnog crossing overa (kada se homologi hromozomi asimetrično sparuju) ili pak nepravilnom razmenom sestara hromatida u mitozi i mejozi balansiranih nosilaca. Duplicirani segmenti mogu biti susedni u istom hromozomu, mogu se nalaziti u različitim hromozomima ili se mogu javiti kao samostalan hromozom sa centromerom. Duplikacije uvek predstavljaju parcijalne trizomije a u zavisnosti od količine i porekla nasledjenog materijala u višku mogu prouzrokovati jasnu kliničku sliku ili pak, vrlo blage fenotipske efekte. Primenom metoda molekularne citogenetike i analizom na molekularnom nivou omogućena je pouzdana postnatalna i prenatalna dijagnoza kako ovih tako i ostalih balansiranih i nebalansiranih strukturnih rearanžmana.
U svrhu prenatalne dijagnoze mogu se koristiti i interfazne ćelije i to najčešće nekultivisane ćelije plodove vode. Prednost ovakvog postupka leži u daleko bržem dobijanju rezultata (približno za 48 sati), u odnosu na analizu metafaznih hromozoma (najmanje 7-10 dana).Takodje, količina potrebnog uzorka za analizu je daleko manja.Ubrzo nakon publikacije,1993.godine ova metoda je široko prihvaćena I postala je sastavni deo rutinskih protokola najvećeg broja kliničkih laboratorija.
Interfazne studije su omogućile i uvodjenje najnovijih metoda molekularne citogenetike, za koje s`pravom očekujemo da će u najskorije vreme postati sastavni deo rutinskih protokola u kliničkim laboratorijama:
- Analiza fetalnih ćelija u krvi majke.FISH je u ovom momentu metoda izbora za analizu veoma malog broja fetalnih eritrocita sa jedrom, izolovanih iz periferne krvi trudnice. Korišćenjem seta proba za hromozome 18,21,X I Y, moguće je sa velikom pouzdanošću detektovati neke od najčešćih trizomija i monozomija u fetalnom kariotipu. Na ovaj način bi se primenom neinvazivne metode brzo i efikasno prenatalno dijagnostikovale najčešće aneuploidije, što je osnov za inaugurisanje tehnike kao skrining metode, posebno u okviru ugroženih grupa pacijenata.
- Preimplantaciona genetska dijagnoza; u pokušaju da se prenatalno testiranje fetalnog kariotipa i postavljanje dijagnoze obavi što ranije i na taj način smanji traumatiziranje porodice i poveća efikasnost procesa genetskog savetovanja, susrećemo se sa problemom sve manjeg i manjeg broja ćelija dostupnih za analizu. FISH stoga postaje nezamenjivo orudje jer u pojedinim slučajevima omogućava analizu samo jedne ćelije. Dalji razvoj ove tehnike je neophodan i njeno uvodjenje u rutinske protokole bi predstavljalo revolucionarni pomak u procesu davanja genetskog saveta porodici jer bi se na ovaj način sprečila dodatna traumatizacija porodice koja je neminovni pratilac selektivnih pobačaja.
Neke monogenske nasledne bolesti se mogu otkriti i sistematskim traganjem, skriningom kod novorodjenčadi. Prvi put je sistemsko traganje primenjeno za detekciju fenilketonurije.Takodje je značajno i za otkrivanje prekliničkih slučajeva i osoba genetski predisponiranih za odredjene bolesti.Ovaj postupak omogućava primenu odgovarajuće terapije pre pojave simptoma bolesti. Takodje, mogućnost detekcije nosilaca recesivnih štetnih gena (heterozigoti za neka patološka svojstva) ima izuzetan značaj zbog visokog rizika ovih osoba da štetni gen prenesu na potomstvo, pogotovo u relativno izolovanim socijalnim zajednicama i kod eventualnog konsangviniteta
Danas se sve više koristi DNK tehnologija za postavljanje dijagnoze i prevenciju naslednih bolesti. Izolacija specifičnih sekvenci DNK i njihovo kloniranje su neophodni uslovi za dijagnostikovanje naslednih poremećaja.Izvori DNK za analizu su jedra limfocita periferne krvi, kultivisani fibroblasti kože,već pomenuti uzorci koji se koriste u oblasti prenatalne dijagnoze kao i gotovo sva tkiva i izlučevine ljudskog organizma u oblasti sudske medicine. Ekstrahovana DNK se seče u fragmente pomoću odgovarajućih restrikcionih enzima.Veliki korak napred u genskoj dijagnostici svakako je učinjen uvodjenjem PCR tehnologije (“polymeraze chain reaction”),koja je omogućila amplifikaciju pojedinih sekvenci DNK korišćenjem specifično konstruisanih prajmera. Njena primena je imala i enorman značaj u sklopu Projekta mapiranja humanog genoma,sa ciljem identifikacije svih DNK markera i gena sadržanih u humanom genomu.Na taj način je omogućena detekcija velikog broja mutacija koje leže u osnovi kako monogenskih bolesti (hemofilija A, Tay-sachs-ova boles,cistična fibroza,Duchenn-ova muskularna distrofija,tubularna miopatija, Sindrom fragilnog X hromozoma i mnoge druge) kao i njihova prevencija, ali i poligenih naslednih poremećaja sa multifaktorijalnom etiologijom medju koje spadaju i brojni psihijatrijski poremećaji. Svakako, daljim istraživanjima u ovoj oblasti medicine i primenom novih sve savremenijih tehnologija izvestan je i značajan napredak u rasvetljavanju promena genetičkog materijala nastalih u neoplazmama kao i tokom procesa ontogeneze (starenja) i kao fundamentalan zadatak uvodjenje genske terapije.
Literatura:
ConnorM, Ferguson-Smith M (1997)Essential Medical Genetics.Blackwell Science Ltd, Oxford.
De Braekeleer M, Dao TN(1990) Cytogenetic studies in couples experiencing repeated pregnancy losses.Human Reproduction,5; 519-28.
Diklić V., Kosanović M., Djukic S., Nikolis J(1994) Biologija sa humanom genetikom. Medicinske komunikacije, Beograd.
Nielsen J, Wohlert M(1991) Chromosome abnormalities found among 34910 newborn children: results from a 13-year incidence study in Arhus, Denmark Human Genetics, 87: 81-3.
Paris Conference (1971): Standardization in human cytogenetics. Birth defects.Original series VII, 7.1972. The National foundation.
Therman E. (1986) Human Chromosomes, Structure, Behavior, Effects II-nd Ed.
Springer-Verlag, New York, Berlin, Heidelberg, Tokyo.
Warburton D, Strobino B (1987) Reccurent spontaneous abortion. In Spontaneous and Recurrent Abortion. Bennett MJ, Edmonds DK. Eds. 193-213.Blackwell Scientific Publications, Boston.
Wilcox A, Weinberg CR., O’Connor JF, et al.(1988) Incidence of early loss of pregnancy. New England Journal of Medicine, 319: 189-94.
Yunis JJ.(1976)High resolution of himan chromosomes. Science, 191: 1268-70.
